江大周景文等改造大肠杆菌创纪录高产泛酸
1、江大周景文等改造大肠杆菌创纪录高产泛酸，产量达826 g/L 近日，江南大学的周景文团队在《Metabolic Engineering》杂志上发表了一项重要研究，题为“Development of a vitamin B5 hyperproducer in Escherichia coli by multiple metabolic engineering”。
原核生物RNA聚合酶全酶的构成即各成分功能
原核生物RNA聚合酶全酶由核心酶和σ因子构成。以下是各成分的详细构成及功能：核心酶： 构成：核心酶由α2ββω亚基组成。 功能： α亚基：具有αCTD和αNTD两部分，通过柔性组件相连。
原核生物RNA聚合酶是一种由五种亚基组成的六聚体，其分子量约为500000。这一聚合酶系统可以进一步细分为核心酶和全酶，其中核心酶由α2ββω亚基组成，而σ因子的加入则使其成为全酶。α亚基具有两个组成部分，即αCTD和αNTD，两者之间通过柔性组件相连。
RNA聚合酶全酶形式为α2ββ’δ，共5个亚基。
RNA聚合酶几种基因如tRNA基因如5SrRNA基因。有些重复顺序如Alu顺序可能也由这种酶转录。上面提到的“TATA”框又称Goldberg –Hogness顺序，是RNA聚合酶Ⅱ的接触点，是这种酶的转录单位所特有的。它在真核生物的转录基因的5’端一侧，在转录起点上游20至30个核苷酸之间有一段富含AT的顺序。
RNA聚合酶全酶是由多个亚基组成的复合体，其组成因生物种类而异。以下是常见生物中RNA聚合酶全酶的主要组成成分： 原核生物（以E. coli为例）：α2：两个α亚基，负责识别启动子。β：一个β亚基，负责催化RNA的合成。β：一个β亚基，与β亚基协同作用。σ：σ因子，帮助全酶识别启动子。
BL21(DE3)菌株转化效率低怎么办?
BL21（DE3）菌株转化效率低的问题可以通过敲除其防御系统基因来解决。这种方法虽然需要进行基因编辑，但一旦完成，将显著提高BL21（DE3）的转化效率，并简化实验流程。此外，该方法对其他大肠杆菌菌株转化效率低的问题同样适用。以上图表展示了几种常用菌株的基因型，从中可以看出BL21（DE3）在防御系统基因方面的特点以及与转化效率高的菌株之间的差异。
可以考虑使用已经过基因编辑、敲除了防御系统的BL21衍生菌株，这些菌株通常具有更高的转化效率。优化转化条件：确保使用高质量的DNA，避免DNA降解或污染。调整转化时的细胞浓度、DNA浓度以及转化时间等条件，以找到最佳的转化参数。
提高转化效率的一个方法是通过基因编辑敲除这些防御系统。例如，对MG1655进行全防御系统敲除可使转化效率提升约170倍。在BL21（DE3）上，可通过编辑hsdR、hsdM、mcrBC-hsdRMS-mrr和mcrA等基因来消除剩余的防御。
使用蛋白酶缺陷型大肠杆菌（如BL21（DE3） pLysS）减少降解；对含稀有密码子的基因，采用Rosetta系列宿主菌（补充稀有tRNA）提升表达效率。
蛋白分泌局限与基因敲除改进：BL21的原始版本在蛋白分泌方面存在局限。为了提升蛋白分泌效率，科学家们采用了基因敲除技术。朱芸等人的研究发现，通过敲除脂多糖合成基因waaF或msbB，可以显著提高BL21的蛋白分泌效率。特别是ΔmsbB和ΔwaaF敲除菌株，它们的出现显著优化了重组蛋白的外分泌性能。
但需注意在冰浴下进行转化操作，以确保转化效率。对于BL21（DE3）pLysS菌株，其携带pLysS质粒，具有氯霉素抗性，且含有表达T7溶菌酶的基因。T7溶菌酶能够溶解大肠杆菌细胞壁，降低目的基因的背景表达水平，同时不影响IPTG诱导的表达。适用于表达毒性蛋白和非毒性蛋白。操作方法与之前提到的菌株相似。
文献解读微型CRISPR/Cas12f1应用于大肠杆菌基因编辑
1、在大肠杆菌中进行基因组编辑时，作者首先将pCas12f1质粒转化到大肠杆菌中，并在含有阿拉伯糖的培养基中诱导l-Red重组酶的表达。然后，将pTarget12f1质粒转化到含有pCas12f1的大肠杆菌中，并在含有阿拉伯糖和抗生素的培养基中筛选重组子。
2、研究意义拓展了微型CRISPR核酸酶工具库：CnCas12f1的成功开发，为基因编辑工具库增添了新的成员，为科研人员提供了更多选择。增进了对CRISPR-Cas12f家族的理解：该研究揭示了CnCas12f1识别C-rich PAM并发挥催化作用的分子机制，为深入理解CRISPR-Cas12f家族的结构生物学特性提供了重要参考。
3、基因重组：CRISPR/Cas12a技术还可以用于基因重组操作，如基因敲入、基因敲除等。通过设计特定的crRNA和Cas12a蛋白，可以实现对目标基因的精确重组，为基因治疗、基因工程等领域提供有力支持。碱基编辑：CRISPR/Cas12a技术还可以结合碱基编辑器实现单碱基替换或转换，而无需引入双链DNA断裂。
天工所张学礼等CRISPR+预埋半复制起点再重组技术获双染色体大肠杆菌_百度...
1、中国科学院天津工业生物技术研究所的张学礼等人利用CRISPR+预埋半复制起点再重组技术，成功构建了双染色体大肠杆菌。具体要点如下：技术原理：在大肠杆菌MG1655中引入了两个含CRISPR靶向位点的编辑盒，通过CRISPRCas9系统进行切割，并利用编辑盒的同源序列进行重组，从而创造出两条独立拥有复制子的染色体。
2、中国科学院天津工业生物技术研究所的张学礼、毕昌昊和大连工业大学的张春枝等人在《Microbial Cell Factories》上的一项创新研究揭示了一种利用CRISPR+预埋半复制起点再重组技术，成功构建了双染色体大肠杆菌的新方法。这项突破性的基因组工程工作表明，通过人为设计和修改，自然生命能够在基因层面实现更复杂的功能。
发表评论